잎의 색소 분리하기(TLC법)

Ⅰ. 서론

복잡한 혼합물은 각 용매에 대한 용해도의 차이를 이용한 크로마토그래피를 써서 분리할 수 있다. 크로마토그래피의 원리는 각 성분들의 혼합물을 적당한 흡착매에 흡착시켜 전개 용매를 써서 개개의 성분을 분리한다. 즉 시료를 함유하는 물질(이동상)이 다른 물질(고정상)에 접촉해서 이동할 때 시료의 각 성분이 이 고정상에 의해 분배 또는 흡착된다.

엽록체 색소는 용매 혼합물상에서 상이하게 용해되기 때문에 용매가 Paper Column 위쪽으로 움직일 때에 어떤 것은 다른 것보다 더 빨리 운반된다.

Ⅱ. 실험목표

⑴ 녹색 잎에 들어 있는 색소를 추출해서 그 성분을 얇은 막 크로마토그래피법(TLC)으로 분리하여 색소의 종류를 알아본다.

⑵ 전개된 색소의 전개율을 계산하여 Rf 값을 구한다.

Ⅲ. 실험재료

시금치, 캡시험관, 모세유리관, 스포이드, 연필, 가위, 자(10cm이상), 얇은 막 크로마토그래피(TLC)

전개액(석유에테르+아세톤), 잎 색소 추출액(메탄올+아세톤), 막자, 막자사발

Ⅳ. 실험과정

① 막자사발에 가위로 잘게 자른 시금치 잎을 넣고 색소추출액 10ml를 2,3회로 나누어 가하면서, 고운 입자가 되도록 갈아 준다.

② 얇은 막 크로마토그래피(TLC) 한쪽 끝에서 1.0cm 되는 곳에 연필로 가늘게 가로선을 긋고, 출발선 중앙에 ●표(원점)를 한다.

③ 가로선 중앙(원점)에 모세유리관으로 광합성색소 추출액을 찍고 마르면 다시 찍는다. 이 과정을 10회 정도 반복한다.

④ 캡시험관에 전개액을 스포이드로 1.5mL 떠서 넣고, 얇은 막 크로마토그래피 끝의 원점이 잠기지 않도록 TLC판을 시험관에 넣고 캡으로 덮는다.(시험관 옆면에 전개액이 묻지 않도록 한다.)

⑤ 전개액이 TLC판 끝에서 1cm 정도 떨어진 부분에 도달할 때까지 전개시킨 후 꺼낸다.(약 10~15분)

⑥ 분리된 각각의 색소에 대하여 전개율(Rf)을 구하여 보자.

* 실험 시 유의사항

① 메스실린더에 전개액을 넣을 때 메스실린더 벽에 전개액이 묻지 않도록 주의한다.

② 얇은 막 크로마토그래피(TLC)를 만질 때는 가장자리를 조심스럽게 만지도록 한다.

③ 원점에 먼저 찍은 색소액이 완전히 마른 뒤에 다시 찍어 원점의 지름이 3mm를 초과하지 않아야 한다.

④ 색소액을 찍은 부분이 전개액 속에 들어가지 않도록 주의한다.

⑤ 색소액을 찍은 얇은 막 크로마토그래피를 시험관에 넣어 고정한 후에는 시험관이 흔들리지 않도록 주의한다.

⑥ 색소액의 농축 정도에 따라 시간이 많이 소요되며 용매전선이 TLC판을 벗어나지 않도록 유의한다.

Ⅴ. 실험결과 및 토의

① 원점에 찍은 색소액은 모두 몇 가지로 분리되었으며, 그 색깔과 색소 명칭은 무엇인가?

② 분리된 색소의 전개율(Rf)을 계산하여 보자.

③ 색소마다 이동 속도가 다른 이유는 무엇일까?

④ 안토시안 색소는 왜 전개되어 나오지 않을까?

⑤ 가을에 단풍이 드는 까닭은 무엇인가?

 Ⅵ. 참고자료

광합성은 엽록체라 불리는 식물의 특수한 기관에서 수행된다. 엽록체는 빛에너지를 화학에너지로 전환시키기에 앞서 빛에너지를 흡수하는 데 필요한 광합성 색소를 가지고 있으며, 주요 색소로는 chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoid, 등이 있다. 엽록소(chlorophyll)는 빛에너지를 흡수하는 주색소이나 보조색소 역시 빛을 흡수하고 에너지를 엽록소에 전달시켜 준다. 보조색소에는 β-carotene, xanthophyll,phycocyanin, phycoerythrine 등이 있다. 이들 색소는 크로마토그래피법에 의해 분리할 수 있다.

잎에 존재하는 두 가지 색소의 농도를 물리적으로 분리하여 측정하는 것이 불가능하거나 불편할 때 우리는 간단히 Spectrophotometer를 사용하여 정확하게 두가지 색소의 농도를 알 수 있다. 이 때는 각각의 색소가 최대의 흡광도를 나타내는 파장인 두 파장에서의 흡광도를 측정해야 한다. 물론 최대흡광도를 나타내는 파장을 알고 있어야 한다. 엽록소a와 엽록소b를 예를 들어보면 엽록소a의 최대흡수파장은 663mm이고 엽록소b의 최대흡수파장은 645mm이다. 두 가지 색소가 흡수하는 여러 파장에서 전체흡광도는 각 색소의 농도와 흡광능력에 따라 달라진다.

◆ 식물색소

식물계에 가장 널리 분포되어 있는 것은 프라보노이드라고 총칭되는 한 무리의 색소로서 꽃, 잎, 줄기, 수피, 재, 종자등 식물의 각부에서 발견된다. 대표적인 것으로는 플라본류가 있다. 담황색이 수용성 색소이며 알칼리성에서는 진한황색으로 변하기 때문에 옛날부터 염료로 사용된 것이 많다. 참마의 수피에 있는 미리세틴, 고삼의 봉오리나 양파의 갈색외피에 들어있는 퀘르세틴, 억새에 전초에 함유되어 있는 루테옿린등은 식물염색의 색소로서 유명하다. 개나리의 노란꽃, 메밀의 전초에는 대량으로 함유되어 있는 루틴은 근래에 약용으로서 동맥경화증의 예방에 사용되고 있다. 꽃의 빨강, 보라, 파랑이나 붉은 단풍을 만드는 안토시안 류를 비롯하여 잇꽃의 색소 카사민은 옛날부터 입술연지나 붉은 염색의 염료로서 중요하다. 이외에도 식물색소는 여러 가지이고 그것의 이용 역시 다양하다.

◆ 색소

물체에 색을 부여하는 물질, 이 물질의 입자가 가시광선 3000 ～7000Å의 어썬 파장 부분을 선택적으로 반사 또는 투과하는데 따라 그 색이 결정된다. 이와 같은 특성은 색소분자의 구조에 따르지만 상세한 기구는 불명이다. 색소가 다른 물질에 흡착 또는 결합하기 쉬운 경우에 염료라고 한다. 색소는 천연색소와 합성색소로 대별되고, 천연색소는 다시 생채색소와 광물색소로, 생체색소는 다시 식물세포와 동물색소르 나뉜다.

종전에 생체색소는 주로 물질이라는 관점에서 연구되어 왔으나, 최근에는 생물활성의 면에서 바라보게 되었다. 광물색소는 광물 그대로, 다소 정제하여 사용되는 것으로, 진사, 계관적, 대자적, 군청 등이 있다. 이것들을 광물염료라고 한다.

◆ 크산토필

꽈리고추, 계란의 노른자 등에서 얻는 카로티노이드 색소, 처음에는 1837년 베르첼리우스가 노랑 잎속에 함유되어 있고 알코올에 잘 녹는 황색색소에 대하여 명명항 것이며 1907년 빌슈테터등이 녹색잎 속에서 추출하여 C40H56O2라는 분자식을 결정하였다. 이 색소는 현재 루테인이라고 불리우는 것이며 그 후 크산토필이라는 색소가 단일한 것이 아님을 알게 되었고 또 널리 동식물에 함유되어 있는 같은 종류의 색도 발견 되었기 때문에 현재는 카로티노이드 중에서 수산기, 카르보닐기, 에테르상 산소등을 함유하는 한 무리의 색소를, 산소를 함유하지 않은 탄화수소계 카로틴류와 구별하여 크산토필류라고 총칭하며, 또 그 중에는 가장 다량으로 존재하는 루테인을 크산토필이라고 하는 경우도 있다.

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