DNA Stain Method

전기영동 후, DNA 조각은 크기에 따라 분리된다. 그러나 DNA 밴드는 무색이므로, DNA를 보기 전에 먼저 염색해야 한다.

EDVOTEK 은 아가 로스 겔 내에서 DNA를 시각화하는 몇 가지 방법을 제공한다.

1. 형광성 DNA 염색

DNA를 시각화하기 위해 가장 자주 사용되는 방법은 형광성 DNA 염색을 사용하는 것이다.

이 염색은 매우 민감하고 빠르게 진행되기 때문에 교실에서 사용하기에 매우 좋으며, 형광 염색은 자외선 (UV) 광원을 통해서만 관찰이 가능하다.

염색약 : InstaStainⓇ Ethidium Bromide / SYBRⓇ Safe DNA Stain

2. 비형광성 DNA 염색

이 염색법은 특수한 장비가 필요하지 않으며 바로 육안으로 확인이 가능하다.

비록 형광 염색보다는 덜 민감하게 반응하지만, DNA를 진한 파란색으로 염색하여 무리 없이 관찰이 가능하다.

염색약 : InstaStainⓇ Blue / FlashBlue™ stain

♣ InstaStainⓇ Ethidium Bromide

가장 일반적으로 사용되는 형광 DNA 염색은 EtBr (Ethidium Bromide)입니다.

개별 EtBr 분자는 "삽입 (intercalation)" 과정에서 DNA 이중 나선의 인접한 염기 쌍 사이를 압착 할 수 있습니다.

UV 광을 사용할 때, EtBr은 잠재적인 돌연변이 유발물질이므로 주의해서 다루어야 하는데, InstaStainⓇ Ethidium Bromide는 특수 용지를 통해 아가 로스 겔에 소량의 얼룩을 전달하여 위험 물질과의 잠재적인 접촉을 최소화하면서 EtBr을 제공합니다.

1. 전기영동장치에서 아가 로스 겔과 트레이를 조심스럽게 제거한 후, 평평한 곳에 펼쳐 놓은 랩 위로 겔을 올려놓습니다. (※전기영동장치에서 겔을 염색하지 마십시오.)

2. 전기영동 완충액 몇 방울로 겔을 촉촉하게 적십니다.

3. 장갑을 끼고 InstaStianⓇ Care의 인쇄되지 않은 면 쪽 투명한 플라스틱 보호 시트를 제거하여 버린 후,

제거한 면 쪽을 겔 위에 놓습니다. 각 InstaStainⓇ Ethidium Bromide 카드는 49cm²의 겔(7*7cm)을 염색합니다.

4. 장갑을 낀 손으로 카드와 겔을 꽉 눌러 기포를 제거하십시오. 기포가 생기면 염색이 되지 않습니다.

5. 트레이를 겔 / 카드 위에 놓고, 트레이 위에 작은 무게의 물건(ex. 빈 유리 비커)을 놓습니다.

이렇게 하면 InstaStainⓇ Ethidium Bromide 카드가 겔 표면에 좀 더 압착될 수 있습니다.

0.8% 겔의 경우 3-5 분, 1.0% 이상의 겔의 경우 8-10분 동안 겔을 염색하십시오.

6. InstaStainⓇ Ethidium Bromide 카드를 제거 후, 긴 파장 자외선 투과기(300nm)를 사용하여 겔을 관찰합니다. DNA가 어두운 배경에서 밝은 주황색 띠로 나타나는 것을 볼 수 있습니다.

♣ SYBRⓇ Safe DNA Stain

SYBRⓇ Safe는 자외선을 가하면 밝은 형광 녹색을 나타내는 DNA 염색약입니다.

EtBr과 유사하게, SYBRⓇ Safe는 특히 DNA 이중 나선에 결합하는 모습을 보입니다.

EtBr과 달리 SYBRⓇ Safe는 EtBr보다 돌연변이 유발성이 적고, 교실에서 사용하기 가장 안전합니다.

1. 실험 메뉴얼에 지정된 대로 희석된 전기영동 버퍼와 agarose 분말을 혼합 후 용액을 끓여서 agarose 분말을 녹입니다.

2. 용액을 1분 동안 높은 온도로 데워준 후, 용액이 담긴 플라스크를 전자레인지에서 조심스럽게 꺼낸 뒤 agarose가 완전히 녹을 때까지 용액을 골고루 저어서 섞어줍니다. (완전히 용해되면 물처럼 투명한 색이 됩니다.)

3. 용해된 agarose를 조심스럽게 흔들며 65℃로 냉각시켜 열이 고르게 분산되도록 합니다.

4. agarose 용액이 냉각되는 동안 겔 트레이를 준비합니다.

5. 겔을 캐스팅하기 전에 용해된 agarose에 SYBRⓇ Safe를 넣고 잘 섞어줍니다.

이 때, agarose 용액은 연한 주황색으로 보일 수 있습니다.

6. 실험 메뉴얼에 지정된 대로 전기영동을 수행하십시오.

긴 겔(>10cm)에서 염료 전면 마이그레이션 문제를 방지하려면 1:10,000 희석으로 전기영동 버퍼에 SYBRⓇ Safe를 추가하는 것이 좋습니다.

길이가 7cm 미만인 젤은 영향을 받지 않아야 합니다.

7. 전기영동이 완료된 후 전기영동 장치에서 겔과 트레이를 제거 후, 트레이에서 겔을 분리해 UV Transilluminator에 넣고 겔을 관찰합니다. DNA는 어두운 배경에서 밝은 녹색 띠로 나타납니다.

♣ InstaStainⓇ Blue

가장 쉽고 편리한 DNA 염색은 InstaStainⓇ Blue입니다.

InstaStainⓇ Blue는 다량의 액체를 제조, 보관 및 폐기할 필요가 없습니다.

각 InstaStainⓇ Blue 카드에는 소량의 청색 DNA 염색약이 들어 있으며, 카드를 물에 넣으면 염색약이 풀립니다.

이 용액은 겔을 동시에 염색 및 착색시켜 액체 폐기물을 최소화하면서 균일한 겔 염색을 제공합니다.

1. 아가 로스 겔을 전기영동 한 트레이에서 꺼내, 75ml 이상의 증류수 / 탈 이온수, 또는 사용한 전기영동 버퍼가 들어 있는 작고 깨끗한 새로운 트레이에 조심스럽게 밀어 넣습니다. (겔은 완전히 잠겨야 합니다.)

* 참고 : 염색 용기로는 적절한 크기의 식품 보관 용기도 사용 가능합니다.

2. 액체 위에 InstaStainⓇ Blue 카드의 파란 면이 겔을 향하도록 부드럽게 띄운 후 30초 후에 카드를 제거합니다.

각 InstaStainⓇ Blue 카드는 49cm²의 젤 (7*7cm)을 염색합니다.

3. 증발을 방지하기 위해 랩으로 트레이를 덮은 채로 3시간 이상 담궈줍니다.

4. 염색 트레이에서 겔을 조심스럽게 제거하고 결과를 관찰하십시오.

♣ FlashBlue™ Stain

FlashBlue™는 아가로스 겔을 간단하고 빠르게 염색할 수 있는 독점적인 DNA 염색약입니다.

1. 10배 농축된 FlashBlue™ 10ml를 플라스크에 90ml의 물로 희석한 후 잘 섞습니다.

2. 전기영동 장치에서 아가 로스 겔과 트레이를 제거한 후 트레이에서 겔을 꺼내 작고 깨끗한 겔 염색 트레이에 밀어 넣습니다.

3. 1x FlashBlue™ 용액을 충분히 부어 겔이 잠기게 한 후 5분 동안 염색하십시오.

5분 이상 겔을 염색하는 경우 추가 탈색 시간이 필요합니다.

4. 겔을 두 번째 작은 트레이에 옮긴 후 물을 부어 겔이 잠기게 하십시오.

부드럽게 흔들어주며 최소 20분 동안 탈색하십시오.

탈색 시간이 길수록 더 좋은 결과를 얻을 수 있으며, 물을 자주 갈면서 탈색해주면 시간을 단축시킬 수 있습니다.

5. 탈색 후 겔을 꺼내서 결과를 확인합니다. DNA는 연한 파란색 배경에 진한 파란색 띠로 나타납니다.

♣ 참고자료

Copyright (C) 2020 Biozoa All Rights Reserved