E.coli 형질전환 (GFP)
Ⅰ. 형질전환이란 무엇인가?
자연에서 일부 박테리아 종들은 변형이라고 불리는 과정을 통해 주변 환경으로부터 외부 DNA를 얻을 수 있으며, 새롭게 얻은 유전 정보는 안정적이다.
실험실에서 과학자들은 대다수의 박테리아(ex. 대장균)가 DNA를 흡수하여 형질 전환하도록 할 수 있으며, 염화칼슘과 온도의 급격한 변화 또는 열 쇼크가 세포벽과 막의 투과성을 변화시켜 DNA 분자가 세포 안으로 들어갈 수 있게 한다.
Ⅱ. 플라스미드란 무엇인가?
염색체 DNA 외에도, 많은 박테리아는 이중 나선 DNA의 작은 원형 조각에 여분이 아닌 필수 유전자를 가지고 있다.
플라스미드로 알려진 이 DNA 조각은 박테리아가 이로운 유전자를 교환할 수 있게 한다.
예를 들어, 항생제 내성을 주는 유전자들은 플라스미드 상의 박테리아 사이에서만 옮겨질 수 있다.
Ⅲ. 유전 공학이란 무엇인가?
유전 공학은 생명 공학을 이용하여 유기체를 변형시키는 것이다. 재조합 DNA 기술은 과학자들이 다양한 근원의 유전자를 박테리아 플라스미드에 주입하는 것을 가능하게 했으며, 일단 변형되면 박테리아는 이러한 플라스미드로부터 대량의 중요한 단백질을 생산할 수 있는데, 이는 실제로 세포를 살아있는 공장처럼 변환시킨다.
이러한 결과로, 당뇨병을 조절하는데 사용되는 인슐린은 유전 공학에서 최초로 개발된 약이었다.
Ⅳ. 플라스미드 DNA를 이용한 대장균의 변형
① 두 개의 마이크로튜브에 각각 “+DNA" 와 ”-DNA"라고 표시해둔다.
② 멸균 된 1mL 피펫을 사용하여 500ul CaCl₂ 용액을 “-DNA” 튜브에 넣는다.
③ 이쑤시개를 사용해 잘 배양 된 약 15개의 콜로니(1~1.5mm 의 크기)를 “-DNA” 튜브에 옮긴다.
④ 이쑤시개에 콜로니가 붙어 있지 않도록 잘 털어주고, 세포가 용해되어 용액이 흐려질 때까지 잘 섞어준다.
⑤ 세포가 용해 된 용액 250ul을 “+DNA" 라고 표기 된 튜브에 넣고, 이 튜브는 얼음 위에 둔다.
⑥ “+DNA”로 표시 된 튜브에 10ul 플라스미드 DNA를 넣는다. “-DNA” 튜브에는 넣지 마십시오.
⑦ 10분 동안 얼음 위에 튜브를 놓는다.
⑧ 변환 튜브를 42° C 수조에 90초 동안 넣어 둔다.
⑨ 다시 튜브를 얼음 위에 놓고 2분간 배양한다.
⑩ 멸균 된 1mL 피펫을 사용하여 각 튜브에 250ul의 회수 액을 넣고 잘 섞어준다.
⑪ 잘 섞어 준 튜브를 37℃ 수조에 넣고 30분 동안 배양한다.
⑫ 세포가 배양되는 동안 프로토콜에 명시 된 대로 4개의 플레이트에 라벨을 붙인다.
⑬ 배양 후, 수조에서 튜브를 꺼내 랙에 놓는다.
⑭ 멸균 1ml 피펫을 사용하여 "-DNA" 라고 표시 된 튜브에서 250ul 세포를 프로토콜에 설명된 대로 특정 플레이트 중앙에 도포한다.
⑮ 새로운 멸균 1ml 피펫을 사용하여 “+DNA” 라고 표시 된 튜브에서 250ul 세포를 또 다른 플레이트에 동일한 방법으로 도포한다.
⑯ 루프를 사용하여 전체 플레이트에 세포를 펴 바른다. “-DNA" 세포와 ”+DNA" 세포를 바를 때 각각 다른 멸균 된 루프로 변경해서 사용해야 한다. 세포가 넓게 펴졌는지 확인한 후 플레이트를 덮고 잘 흡수되도록 5분 정도 기다린다.
⑰ 플레이트를 서로 겹쳐서 쌓아두고 그룹 번호를 표기해둔다. 이 플레이트들을 37℃ 인큐베이터에 거꾸로(한천 쪽이 위를 향하도록) 놓고 하룻밤 정도(16-18시간)를 배양한다. 인큐베이터가 없다면 상온에서 약 24-48 시간 정도 둔다면 콜로니가 형성 될 것이다.
⑱ 배양 된 결과를 시각화한다. 실험실을 어둡게 한 후 UV 램프로 비춘다.
Ⅴ. 실험 요약
플레이트의 E.coli는 얼음처럼 차가운 CaCl₂ 용액에 넣어준다. 플라스미드 DNA는 42℃ 수조에서 열 충격을 받기 전에 세포 절반에 추가되며, 열 쇼크 단계는 박테리아 세포에 DNA가 들어가는 것을 촉진한다.
회수액을 세포 현탁액에 넣고 37℃에서 30분간 세포를 회복시킨다. 이 회복 시간은 박테리아가 그들의 세포벽을 수리하고 항생제 내성 유전자를 발생시키도록 한다.
마지막으로 형질전환된 대장균을 LB플레이트에 도말하고 37℃에서 밤새 배양한다.
Ⅵ. 참고 사항
세포가 배지로 흡수되는 데 더 오래 걸릴 수 있으니 세포가 완전히 흡수되지 않으면 플레이트를 뒤집지 마십시오.
Ⅶ. 문제해결방법
문제 | 원인 | 해결방안 |
플레이트에 세포가 잘 자라지 않는 경우 | 배양 시간이 너무 짧음 | 37℃에서 총 16-20 시간 동안 플레이트를 배양한다. |
항생제가 플레이트에 첨가 됨 | 플레이트에 세포 배양 시, 정확한 단계에서 항생제와 첨가제를 사용해야 한다. |
잘못 된 배양 온도 | 인큐베이터 온도를 체크하기 위해 온도계를 사용한다. 잘못 설정되어 있는 경우 온도를 37℃로 조정한다. |
변환 플레이트에서 볼 수 있는 주변 콜로니 | 플레이트 안의 항생제 농도가 잘못됨 | 플레이트에 항생제를 올바르게 첨가했는지 확인하고, 항생제를 첨가하기 전에 ReadyPour가 60℃로 냉각되었는지 확인한다. |
항생제 농도가 저하됨 |
플레이트가 너무 오래 배양됨 | 플레이트는 37℃에서 약 16-18시간 정도만 배양한다. |
변환 플레이트에 콜로니가 번지는 경우 | 형질전환 물질을 포함하는 플레이트를 너무 빨리 뒤집음 | 플레이트를 뒤집기 전에 도포한 용액이 충분히 흡수되도록 한다. |
플레이트가 너무 습한 경우 | 세포 도말 후 플레이트를 상온에서 밤새 건조시키거나, 세포를 도말하기 전에 37℃에서 30분간 따뜻하게 둔다. |
변환 플레이트에 콜로니가 보이지 않는 경우 | 변환 튜브에 플라스미드 DNA가 추가되지 않음 | 플라스미드DNA가 변환 튜브에 추가되었는지 확인한다. |
피펫이 올바르게 사용되고 있는지 확인한다. 학생들의 경우 미숙할 수 있으므로 피펫 사용법을 연습해야 한다. |
형질 전환에 사용 된 잘못 된 숙주세포 | 정확한 박테리아 균주가 형질 전환에 사용되었는지 확인한다. |
세포가 적절하게 열을 받지 못함 | 온도가 42℃인지, 90초 이내에 열 충격 단계가 발생했는지 확인한다. |
잘못 된 항생제 사용 | 올바른 항생제를 사용했는지 확인한다. |
낮은 변환 효율성 | 변환에 사용되는 세포가 충분하지 않음 | 플레이트에서 더 많은 콜로니를 선택한다. (500ul CaCl₂ 당 1-2mm 폭으로 15 콜로니) |
플레이트가 20시간 이상 배양 됨 | 세포가 20시간 이상 자랄 수 없으므로 필요한 경우 20시간 후부터는 냉장고에 보관한다. 24시간 이상 배양 한 후 냉장보관 한 플레이트는 사용하지 않는다. |
실험 플레이트가 너무 오래됨 | 변환플레이트를 준비하고 바로 사용한다. |
세포가 CaCl₂에 잘 섞이지 않음 | CaCl₂에 세포를 모두 주입 후 덩어리를 남기지 않고 잘 섞어준다. 세포를 넣은 용액이 흐려져야 한다. |
충분히 차갑지 않은 CaCl₂ 용액 | CaCl₂에 세포를 추가하기 전에 CaCl₂를 사전 냉각시킨다. |
충분히 차갑지 않은 세포 용액 | 얼음 위에서 CaCl₂ + DNA의 세포 배양 시간을 연장한다.(추가 10-15분, 30분을 넘지 않을 것.) 이 과정은 더 많은 DNA가 박테리아 세포 외부에 달라붙도록 한다. |
세포 용액에 플라스미드DNA를 너무 많거나 혹은 너무 적게 첨가함 | 변환 튜브에 올바른 양의 플라스미드가 추가되었는지 확인한다. 학생들이 마이크로피펫 사용에 미숙할 수 있으니 피펫 사용법을 연습해야 한다. |
세포가 적절한 열 충격을 받지 못함 | 온도는 42℃로 설정해야 하고, 열 충격을 90초 정도 가해야 한다. |
플레이트에 주입하기 전에 항생제가 분해됨 | 항생제를 첨가하기 전에 ReadyPour가 60℃로 냉각되었는지 확인한다. |
플레이트에 잘못 된 항생제 주입 | 항생제 농도가 올바른지 확인한다. |
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